Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Инициируемый комплементом гемолиз. Для измерения степени гемолиза к испытуемому образцу добавляют 600 мкл предварительно нагретого до 370С буферного раствора альбумина и барбитала, осторожно ресуспендируют клетки путем не менее чем пятикратных повторных пипетирований и помещают кювету в термостатированный держатель кювет спектрофотометра. Через 2 минуты добавляют 200 мкл разведенного комплемента морских свинок (125-200 СН50/мл), тщательно перемешивают путем двукратного пипетирования и тотчас же после второго пипетирования начинают регистрацию оптической плотности при длине волны 541 нм в зависимости от времени с использованием в качестве раствора сравнения буферного раствора альбумина и барбитала. Измерение прекращают при очевидном прохождении графиком зависимости оптической плотности от времени точки перегиба.
Оценка. Определяют угол наклона (S) кривой гемолиза в районе точки перегиба путем сегментации участка с наибольшим уклоном на подходящие временные отрезки At (например, At = 1 мин) и вычисляют значения S между соседними точками пересечений, выраженные в АА/мин. Наибольшее значение S принимают за (Sexp). Кроме того, определяют оптическую плотность в начале измерения (As) путем
экстраполяции кривой, практически линейной и параллельной оси времени в течение первых нескольких минут. Значение (Sexp) корректируют по формуле:
S
SI _ exp
“X
Вычисляют среднее арифметическое значений S’ для каждого препарата. Вычисляют индекс функции Fc (IFc) по формуле:
, _ 100 • (S' - Ж)
1 Fc _ -- -- J
S' s - S' c
где:
S' - среднее арифметическое корректированного угла наклона для
испытуемого препарата,
S's - среднее арифметическое корректированного угла наклона для
препарата сравнения,
S'c - среднее арифметическое корректированного уклона для контроля
комплемента.
Вычисляют индекс функции Fc для испытуемого препарата: значение должно быть не ниже указанного на листке-вкладыше, сопровождающем препарат сравнения.
2.7.10. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА VII
Количественное определение фактора свертывания крови VII производят по его биологической активности в виде комплекса фактора Vila с тканевым фактором при активации фактора Х в присутствии ионов кальция и фосфолипидов. Активность препарата фактора VII оценивают путем сравнения количества, необходимого для достижения определенной скорости образования фактора Ха в испытуемой смеси, содержащей вещества, принимающие участие в активации фактора Х, и количества Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, которое требуется для достижения такой же скорости образования фактора Ха.
За Международную Единицу принимают активность фактора VII в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенной из замороженного состояния плазмы. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
Хромогенный метод количественного определения включает две последовательные стадии. Первая стадия состоит в зависящей от фактора VII активации фактора Х смесью реагентов, включающей тканевый фактор, фосфолипиды и ионы кальция. На второй стадии происходит ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором Ха с образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между скоростью образования фактора Ха и концентрацией фактора. Содержание метода количественного определения описывается схемой 2.7.10.-1:
Тканевый фактор + Са++
1-я стадия а) Фактор VII Фактор VIIа
Фактор VIIа + Ca++ + тканевый фактор/фосфолипид b) Фактор X ------------------------------------------------»- Фактор Ха
Фактор Ха
2-я стадия хромогенный субстрат -----------> пептид + хромофор
Схема 2.7.10.-1. - Схема количественного определения фактора коагуляции крови
человека VII.
В обеих стадиях используются реагенты, доступные из ряда коммерческих источников. Хотя в состав реагентов могут вноситься некоторые изменения, их основные свойства должны соответствовать нижеприведенным спецификациям.
РЕАГЕНТЫ
Реагент факторов коагуляции состоит из очищенных белков человеческого или говяжьего происхождения, включающих фактор Х и тромбопластиновый тканевый фактор / фосфолипид в качестве активатора фактора VII. Эти белки подвергнуты частичной очистке и не должны содержать примесей, мешающих активации фактора VII или фактора Х. Фактор Х содержится в количествах, приводящих к конечной концентрации на первой стадии определения, находящейся в пределах от 10 до 350 нмоль/л, предпочтительно от 14 до 70 нмоль/л. В качестве тканевого фактора/фосфолипида может использоваться тромбопластин, полученный из природных источников, например, из мозга крупного рогатого скота или кроликов, или синтетический препарат. Тромбопластин, подходящий для использования в определении протромбинового периода, разбавляют буфером в соотношении от 1:5 до 1:50 так, чтобы окончательная концентрация ионов кальция составляла от 15 до 25 ммоль/л. Образование конечного фактора Ха проводят в растворе, содержащем человеческий или бычий альбумин в концентрации, не допускающей потери адсорбции, и соответствующим образом буферизированного до рН 7,3-8,0. В окончательной инкубационной смеси фактор VII должен быть единственным компонентом, лимитирующим скорость.
